加快衰老的因素：洗澡僅第三，排在第一的惡習，很多人改不掉
關(guān)鍵詞：衰老
除了經(jīng)典的核糖核苷酸A、U、C、G，生物體內還有大量的遺傳修飾核苷酸，即所謂的表觀(guān)遺傳修飾。它們像籬笆上的燈籠一樣裝飾著(zhù)RNA，調節著(zhù)基因表達、mRNA剪接、疾病發(fā)生等各種重要的生命過(guò)程。
到目前為止，科學(xué)家已經(jīng)成功鑒定了170多種表觀(guān)遺傳修飾，但這些只是冰山一角。為了在轉錄組水平實(shí)現完整修飾的作圖，自然細胞生物學(xué)和分子生物學(xué)的封面綜述呼吁開(kāi)發(fā)一種方法來(lái)直接定位和定量RNA的所有表觀(guān)遺傳修飾。
RNA修飾分析可以通過(guò)薄層色譜（TLC）、高效液相色譜-紫外分光光度法（HPLC-UV）或高效液相色譜-質(zhì)譜（HPLC-MS）進(jìn)行。這些方法可以同時(shí)測量大量的RNA修飾，但很難提供序列信息?；诘诙鷾y序（NGS）的方法可以通過(guò)抗體免疫沉淀或化學(xué)修飾來(lái)繪制整個(gè)轉錄組的RNA修飾圖譜。這些方法只能檢測有限種類(lèi)的修改，并且通常只針對一種特定的修改。仍有大量的RNA修飾無(wú)法檢測或定位。
新興的納米孔測序技術(shù)可以直接對長(cháng)鏈RNA進(jìn)行測序，無(wú)需逆轉錄和PCR擴增，有望直接讀取RNA上所有的修飾信息。然而，由于通道分辨率有限，修飾核苷酸引起的離子電流變化也與其周?chē)蛄杏嘘P(guān)，這為準確判斷修飾的類(lèi)型和位置以及同時(shí)檢測多個(gè)修飾帶來(lái)了挑戰。
近日，南京大學(xué)化學(xué)化工學(xué)院黃碩教授團隊發(fā)表了一篇研究論文，題目為：在Nature Nanotechnology中使用工程化納米孔識別核苷單磷酸及其表觀(guān)遺傳修飾。
本研究構建了一種高分辨率的恥垢分枝桿菌膜蛋白A（MspA）納米孔，可以準確識別所有經(jīng)典核苷酸及其主要修飾。野生MspA納米孔是天然的八聚體，如何在其中引入獨特的功能位點(diǎn)尚未見(jiàn)報道。
研究團隊通過(guò)原核共表達系統成功將一種含半胱氨酸突變的單體引入八聚體，實(shí)現了異質(zhì)MspA納米孔的構建。然后通過(guò)馬來(lái)酰亞胺苯硼酸與巰基的邁克爾加成反應，進(jìn)一步將唯一的苯硼酸適體引入通道。利用苯硼酸和順式二醇對核苷酸的可逆相互作用，研究團隊完全區分了四種經(jīng)典核苷酸（C、U、A、G），其效果遠優(yōu)于現有報道，充分證明了非均相MspA通道檢測核苷酸的可行性和高分辨率。
研究團隊進(jìn)一步將該方法應用于RNA表觀(guān)遺傳修飾的檢測，實(shí)現了多達7種常見(jiàn)修飾核苷酸的同時(shí)檢測，包括5-甲基胞苷（m5C）、N6-甲基腺苷（m6A）、N7-甲基鳥(niǎo)苷（m7G）、N1-甲基腺苷（m1A）、肌苷（I）等。
這是nanopore首次報道對如此多種核苷酸修飾的直接檢測和完美區分，充分展示了MspA對微小結構差異甚至修飾異構體的優(yōu)異分離度。該方法理論上適用于各種核苷酸、核苷酸修飾和核苷酸衍生物的檢測。
隨后，研究團隊開(kāi)發(fā)了RNA表觀(guān)遺傳修飾信號數據庫的機器學(xué)習算法，以輔助納米孔事件的自動(dòng)識別。通過(guò)選取每種核苷酸的500個(gè)標準事件作為訓練集，并對各種機器學(xué)習模型進(jìn)行評估，研究團隊獲得了最優(yōu)的線(xiàn)性SVM模型。該模型能以99.6%的準確率區分11種核苷酸，并能識別混合核苷酸樣品的成分，為真實(shí)環(huán)境下的核苷酸檢測提供了自動(dòng)化數據分析工具。
為了直接檢測RNA的修飾，研究小組開(kāi)發(fā)了一種“拆成幾部分“的方法來(lái)檢測天然RNA的完整修飾圖譜。他們利用核酸外切酶將天然RNA消化成單個(gè)核苷酸，然后利用高分辨率納米孔檢測和機器學(xué)習分析，獲得消化產(chǎn)物中核苷酸的組成和豐度，最終重構出原始RNA的序列組成和修飾信息。利用這一策略，研究團隊成功檢測到胃腸道腫瘤患者M(jìn)icroRNA中的m5C和m6A修飾，為直接識別microRNA中的表觀(guān)遺傳修飾提供了一種快速便捷的單分子分析方法。
為了進(jìn)一步擴大該策略的普適性，研究小組將其應用于tRNA修飾圖譜的檢測。作為高度修飾RNA的代表，tRNA中已鑒定出90多種修飾類(lèi)型。以酵母苯丙氨酸tRNA為例，成熟的酵母苯丙氨酸tRNA含有11個(gè)化學(xué)修飾，包括D、、m5C、m7G、m1A、m22G、m2G、T、Y、Cm和Gm。Cm和Gm不能被苯硼酸修飾的MspA納米孔檢測到，因為它們的結構中缺少順式二醇。通過(guò)感知酵母苯丙氨酸tRNA的消化產(chǎn)物，團隊成功繪制了酵母苯丙氨酸tRNA的修飾圖譜，并確定了其余9個(gè)修飾的存在，其豐度與理論結果基本一致。
該方法無(wú)需對RNA消化產(chǎn)物進(jìn)行預分離，即可快速定量鑒定天然RNA中已知和未知的修飾，為發(fā)展切割測量的納米孔表觀(guān)遺傳測序提供了重要的設計策略和研究方法。