空腹血糖無(wú)異常，餐后卻超10？建議：超60歲加測這項指標
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北京科學(xué)與類(lèi)腦研究中心（CIBR）熊巍實(shí)驗室在 Cell子刊 Cell Reports發(fā)表的題目是：在人類(lèi)DFNB23非綜合征性耳聾模型p CDH15AV-3J小鼠中的模板非依賴(lài)性基因組編輯（應用于人類(lèi)非綜合征性耳聾DFNB23動(dòng)物模型Pcdh15av-3j小鼠品系的不依賴(lài)修復模板的基因編輯）。
首次在哺乳動(dòng)物模型上展示了利用非同源末端連接的基因修復通路有效實(shí)現先天性遺傳疾病的在體基因治療。
DNA水平基因修復成為下一代基因治療新方向
基因治療是治療由基因突變引起的遺傳病的金鑰匙。目前，大多數工作都集中在mRNA的基因替換或基因沉默上。一些適用性較好的靶基因已經(jīng)應用于臨床，顯示了基因治療的可行性。但就中心法則而言，mRNA水平的修復仍是治標不治本，因此針對DNA的基因修復代表了下一代基因治療的新方向。本研究提出了專(zhuān)門(mén)針對DNA移碼突變的方案，系統論證了耳蝸毛細胞DNA水平的基因編輯可以有效恢復動(dòng)物聽(tīng)力。
以CRISPR-Cas為代表的基因編輯技術(shù)實(shí)現了DNA層面的基因修復。隨著(zhù)2011年CRISPR-Cas工具的發(fā)展和成熟，研究人員可以依賴(lài)guide RNA（gRNA）。
實(shí)現穩定可控的定點(diǎn)DNA雙鏈切割/斷裂（DSB），CRISPR-Cas技術(shù)的一個(gè)重要應用就是實(shí)現定點(diǎn)切除致病突變。DSB的修復有諸多通路，其中最主要的是NHEJ和同源重組修復（HDR）兩種：NHEJ產(chǎn)物攜帶各種插入或者缺失（InDel）導致的移碼突變，其結果等同于從一個(gè)突變到多種突變，因此沒(méi)有得到基因治療的很好應用；依賴(lài)HDR修復通路將靶基因修復為野生型，但是這一過(guò)程需要有一個(gè)野生型的DNA模板，然而在體情況下基于HDR通路的修復效率在活體動(dòng)物的終端分化細胞上效率非常低，從一定程度上限制了基因編輯在基因治療上的應用。因此基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療方案一直處于實(shí)驗室和細胞系體系研究階段。
首次在哺乳動(dòng)物模型上展示了利用NHEJ基因修復通路實(shí)現先天性遺傳疾病的在體基因治療
自2016年以來(lái)，陸續有基于細胞系的研究表明gRNA-spCas9酶切割產(chǎn)生的DSB的末端連接產(chǎn)物并非隨機，而是可以預測和重復實(shí)現的，那么基于這一原理，對于某一個(gè)gRNA所獲得DNA編輯事件可以預測，反過(guò)來(lái)說(shuō)可以根據DNA產(chǎn)物需要來(lái)選擇gRNA。然而這一規律在體內的實(shí)際情況是怎么樣的并不知道，該研究即利用小鼠耳蝸培養組織驗證了終端分化的功能細胞上編輯產(chǎn)物也具有可重復性，并利用該原理實(shí)現了單個(gè)gRNA即可修復移碼突變，實(shí)現小鼠的在體基因治療。
本研究展示了接收聲音振動(dòng)的聽(tīng)覺(jué)毛細胞可以利用內源性DNA修復通路中的最主要方式NHEJ（大于90%）修復InDel導致的移碼突變，在遺傳性耳聾動(dòng)物模型（Pcdh15av-3j小鼠，攜帶一個(gè)腺苷的插入突變）上實(shí)現了導入單個(gè)gRNA有效修復該插入導致的遺傳性耳聾，而PCDH15蛋白是毛細胞tip link的組分，是毛細胞機械轉導通道開(kāi)放的關(guān)鍵蛋白，蛋白質(zhì)量有215kD之巨。該概念的成功驗證提示占人類(lèi)22%的移碼突變導致的遺傳性疾病有廣闊的治療前景。
從體外組織和在體動(dòng)物兩個(gè)層面展示通過(guò)NHEJ通路實(shí)現移碼突變的修復以及聽(tīng)覺(jué)和平衡覺(jué)功能的部分修復
熊巍實(shí)驗室長(cháng)期研究耳聾相關(guān)基因的生理和病理機制，本工作利用一株模擬人類(lèi)DFNB23遺傳性耳聾的Pcdh15av-3j小鼠品系，全方位系統的展示了突變位點(diǎn)附近產(chǎn)生的DSB可以通過(guò)NHEJ通路實(shí)現移碼突變的修復以及聽(tīng)覺(jué)和平衡覺(jué)功能的部分修復。本研究在體外組織和在體動(dòng)物兩個(gè)層面，從編輯基因產(chǎn)物、蛋白表達、毛細胞功能、以及動(dòng)物生理功能等多個(gè)角度的分析和評估來(lái)展現該方案的可行性。
組織層面：
耳蝸毛細胞的基因遞送一直是一個(gè)難點(diǎn)，熊巍博士早前開(kāi)發(fā)了一套耳蝸組織培養和基因電轉遞送的系統解決方案（Xiong et al.,Nat. Protoc.2014），實(shí)現在培養的耳蝸組織上通過(guò)電轉（較大規模）向毛細胞導入外源基因，后續通過(guò)電生理或者鈣成像研究特定基因干預后的毛細胞功能變化?；谠摱侂娹D技術(shù)，熊巍實(shí)驗室首先掃描了av-3j突變（1bp插入）上下游15bp的區域內的4條gRNA所產(chǎn)生的編輯產(chǎn)物，發(fā)現其中的m-3j-gRNA1表現出高比例的1bp刪除的編輯產(chǎn)物，而且重復性很高，意味著(zhù)m-3j-gRNA1是一個(gè)潛在的治療av-3j突變的備選gRNA。在培養的Pcdh15av-3j耳蝸組織上，通過(guò)電轉表達了spCas9和m-3j-gRNA1的Pcdh15av-3j毛細胞可以恢復PCDH15蛋白的表達（Pcdh15av-3j突變導致PCDH15不表達上膜），同時(shí)Pcdh15av-3j毛細胞的機械轉導功能也有所恢復。有意思的是，在包括-1bp、-4bp、+2bp等在內的回碼（frame-restored）產(chǎn)物類(lèi)別中，其最高占比產(chǎn)物均對PCDH15功能有明顯恢復，提示蛋白修復產(chǎn)物在非保守區即使1-2氨基酸的插入或者刪除并非絕對無(wú)功能，從轉化角度考慮也是值得去開(kāi)發(fā)的一種可能性。
在體層面：
根據體外研究的效果，熊巍實(shí)驗室進(jìn)一步對Pcdh15av-3j小鼠在體耳蝸注射包裹有m-3j-gRNA1的AAV2/9。通過(guò)對電轉耳蝸組織（體外）和病毒注射耳蝸組織（在體）的基因編輯產(chǎn)物進(jìn)行的系統比對，發(fā)現它們無(wú)論是在主編輯產(chǎn)物還是產(chǎn)物的比例上均非常一致。進(jìn)一步的對m-3j-gRNA1病毒注射小鼠的各方面指標的評估，包括耳蝸毛細胞的PCDH15表達（蛋白表達）、耳蝸毛細胞的機械轉導電流（細胞功能）、小鼠的聽(tīng)性腦干電位（ABR，聽(tīng)覺(jué)生理）和驚嚇?lè )磻⊿tartle，行為學(xué)）等，均顯示單個(gè)m-3j-gRNA1在spCas9的幫助下即可實(shí)現av3j突變的功能性恢復。熊巍實(shí)驗室同時(shí)也檢驗了前庭器官的恢復效果，結果顯示Pcdh15av-3j小鼠在注射m-3j-gRNA1后也得到了平衡功能的恢復。
為基于基因編輯技術(shù)的在體基因治療提供進(jìn)一步支持
基因藥是繼化學(xué)藥之后的基礎和臨床各機構研發(fā)的下一代藥物的重點(diǎn)方向，在人體基因遞送和基因表達等技術(shù)門(mén)檻陸續解決的情況下，遺傳性疾病的基因治療的前景越來(lái)越明確。2012年CRISPR-Cas技術(shù)的橫空出世，提供了有效且實(shí)用的DNA編輯工具，讓面向DNA的在體基因治療成為可能?；瘜W(xué)藥和基因替代/沉默等手段通常只能做到治標不治本，而面向DNA的基因編輯帶來(lái)的基因修復，可以讓被修復基因跟隨生命體的生長(cháng)節奏在時(shí)間上和空間上實(shí)現內源表達調控，是最自然的基因表達和調控的體現，也應該是最理想的針對遺傳性疾病的修復方式。