蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑發(fā)生什么反應
蛋白質(zhì)與雙縮脲試劑反應呈現紫色，這一現象基于肽鍵與堿性銅離子的絡(luò )合作用，常用于生物化學(xué)檢測。反應原理涉及蛋白質(zhì)肽鍵在堿性條件下與Cu2?形成紫色絡(luò )合物，顏色深淺與蛋白質(zhì)濃度成正比。
1. 反應原理
雙縮脲試劑由氫氧化鈉、酒石酸鉀鈉和硫酸銅組成。堿性環(huán)境使蛋白質(zhì)肽鍵（-CO-NH-）解離，氮原子孤對電子與Cu2?配位形成四齒螯合物。該絡(luò )合物在540nm波長(cháng)處有最大吸收峰，紫色深淺直接反映肽鍵數量。反應特異性針對含兩個(gè)以上肽鍵的化合物，單氨基酸無(wú)此反應。
2. 檢測應用
臨床生化檢驗常用該方法測定血清總蛋白，正常參考范圍60-80g/L。操作時(shí)將試劑與樣本按1:20比例混合，37℃孵育10分鐘后比色。需注意高脂血癥樣本可能產(chǎn)生渾濁干擾，此時(shí)可選用雙縮脲-溴甲酚綠聯(lián)合檢測法。實(shí)驗室常用牛血清白蛋白作為標準品制作校準曲線(xiàn)。
3. 干擾因素
血紅蛋白、膽紅素等色素物質(zhì)可能影響比色結果，需作樣本空白對照。銨離子濃度超過(guò)10mmol/L會(huì )與銅離子競爭結合，導致顯色減弱。含EDTA的抗凝血漿會(huì )螯合銅離子，應避免使用。某些藥物如磺胺類(lèi)可能產(chǎn)生沉淀，需離心后取上清檢測。
4. 方法優(yōu)化
自動(dòng)化分析儀采用兩點(diǎn)終點(diǎn)法，在546nm和700nm雙波長(cháng)檢測消除濁度干擾。微量檢測可使用96孔板模式，樣本量?jì)H需5μL。為提高靈敏度，可添加表面活性劑如Triton X-100增強顯色穩定性。實(shí)驗室應定期驗證試劑線(xiàn)性范圍，通常要求r2≥0.995。
該反應是蛋白質(zhì)定量金標準，具有操作簡(jiǎn)便、成本低廉的優(yōu)勢。實(shí)際應用中需結合樣本類(lèi)型選擇合適前處理方法，異常結果應結合電泳或免疫檢測復核。維護儀器比色系統的準確性對保證檢測質(zhì)量至關(guān)重要。
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